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制备抗体如何选择抗原,选多肽还是选蛋白呢?
     上篇文章讲到文渊阁通过开发新型佐剂技术使得16天两次免疫的抗体滴度大幅提升,OVA抗原达到700k,福氏佐剂仅达到2k。但是好的抗体不仅与抗体滴度有关,而且也与抗原的表位关系密切。
      蛋白质通过原核重组表达,这是常用的抗原形式。这种重组蛋白的重要特征是表位比较丰富,免疫原性也相对较强。用之制备的多抗,通常带有非特异信号,背景也不是那么干净。用来制备单抗,再通过单抗杂交瘤的筛选可以有效的去除非特异性抗原表位的干扰。所以用重组蛋白制备单抗是经典的方法。然而这一制备途径有其弊端,首先单抗完整的制备周期至少是5个半月(文渊阁的新型免疫技术可减少一个半月),时间比较长,工作量比较大,成本自然较高,风险也较高。另外真核蛋白原核表达的可表达性约为50%,这是世界性难题,不然没有必要发展其他表达体系。对于诊断试剂的开发,基本上必须使用这一途径进行单抗制备。然而对科研级抗体,文渊阁认为没有必要这样操作,可另辟两条蹊径。
      客户只需提供蛋白质序列,文渊阁便可通过独有算法软件选择两个表位,然后通过多肽的化学合成获得这两个高纯度表位,然后将其分别偶连到载体蛋白上进行免疫,最后再通过多肽的亲和纯化,只纯化与此表位结合抗体,其他无关抗体被严格洗脱除去。这样得到抗体只与所选择的表位结合,特异性与单抗一致,此种抗体的兔源抗体亲和力很容易高于鼠源单抗。然而很多客户可能会遇到一种现象,用化学合成的多肽所制备的部分抗体对多肽本身识别性很好,然而却不能有效识别western高丰度蛋白。这该如何解释呢?文渊阁一直在研究这一问题,并使之得到彻底解决。次要因素为多肽合成中的小分子未清除干净,多肽合成中的旋光性未得到有效控制。而主要因素则为偶联多肽产生的构象与蛋白原有构象不匹配。文渊阁在佐剂中添加干扰多肽和载体蛋白氢键的一定分子量的物质,从而使偶联的多肽构象与蛋白(尤其是western膜上的蛋白)一致。文渊阁曾以BSA为研究对象,设计12条随机肽(未用表位设计软件),用传统的非干扰佐剂仅3条实现BSA蛋白的blotting识别,而用干扰性佐剂则实现11条的有效识别,最后一条也识别,只是识别性能很弱。通过这样的技术文渊阁就可以在很短时间内为客户制备高亲和力,高特异性抗体,而客户只需支付实验动物和多肽合成的极少费用即可。
      以多肽为基础的单表位抗体在WB,IHC,ICC上能得到很好的应用,但在IP实验方面的应用,反而拥有多个表位的蛋白抗原更具优势,因为蛋白抗原具有多个表位,所制备的抗体很容易在免疫下拉实验中与样品中的蛋白形成空间网格结构,这一结构会将目标蛋白“一网打尽”,所以蛋白抗原的制备及免疫并没有由于文渊阁的多肽抗原技术而放弃,而是得到了优化和发展。首先文渊阁会通过三维建模技术获得蛋白的独立结构域,并进行约300-500个氨基酸的结构域截短表达,从而极大的增进的真核蛋白的原核可表达性。其次文渊阁会依次通过两种纯化手段获得蛋白的高纯度,进而增加了抗体的特异性。再者,文渊阁使用无卡介苗无杂蛋白抗原的新型佐剂,避免了杂质免疫原的引入。最后,文渊阁可通过蛋白的抗原区分性亲和纯化,从而使抗体的特异性大幅提升。由此,文渊阁可为客户提供更高品质的蛋白抗原抗体。
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