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Western实验如何才能获得完美结果,其影响因素有哪些?
    
 
      Western的目标是要实现膜上蛋白的特异性检测,很多客户会遇到以下几个问题:1,没检测出来信号。2,背景很脏,有时脏的都看不见真正信号。3,条带不直,扭扭曲曲。4,这次做出来,下次就做不出来了,很不稳定。5,很多时候抗体和样品比较珍贵,一旦实验不理想,虽下一次操作格外小心,但由于原因出于样品和抗体之外,实验仍然不理想,进一步的实验进度受到拖延。6,发光液易淬灭,显影液易失效,二抗在渐变失活,一抗质量不过硬,封闭液易变质以至封闭及回收抗体的保存都不稳定,这些都是额外的变数。
      所以western要想轻松完美的获得结果,要在几个方面注意。1,上样量要尽量的大,2,电泳转膜一定要高效,最好实现胶上100%的蛋白转移到膜上。3,封闭液一定要稳定高效不仅要实现超低背景最好还能有效的保存回收抗体。4,在以上三个条件下,发光液灵敏度要绝对的高,最好使用飞克级发光液,并且最好是长效发光和高稳定。5,在western过程中要加质控性手段,一旦系统如一二抗,发光液,显影液失效,可立即找到问题,并加以解决。6,要获得高效的膜上抗体高效剥离液,这种剥离液高效去除一二抗,而又不伤害抗原,这对加速western实验是非常有力的。
       文渊阁生物通过实验数据结合数学推导,得出几个原创结论:1,WB的检测灵敏度正比于发光液的发光灵敏度,受限于标记二抗的活性及底物形成的系统。2,当抗体亲和力较高时,抗体的稀释度的调整在很大范围上是不会影响最终检测灵敏度的,但抗体稀释度会成为反应快慢的影响因素。3,当抗体亲和力较低时,抗体的稀释度将大幅的接近反比的方式降低检测灵敏度。4,western系统的可通过“闭合”的技术组合实现高度的稳定和高效。
        下一篇文章,将着重阐明文渊阁生物是如何通过技术把控,实现western的高度稳定和高效的。
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