Cloneget克隆系统

      本试剂盒为非内切酶依赖的克隆系统，可快速和高通量的将PCR产物定向克隆到任何载体中，只需将200bp到15kb的PCR片段与线性化的载体混合，用本试剂盒提供的专有酶处理30分钟后即可转化，阳性率在95%以上。(具体原理见下图) 
   
主要特色:
1, 快速，定向的克隆PCR产物，阳性克隆比例高（95%以上）。
2，PCR产物与线性化载体无需酶切，去磷酸化处理，适合高通量克隆。
3，可有效克隆15kb的DNA片段。
4，如果长片段不易PCR扩增获得，可将次长片段分解为2-4个较短片段分别扩增，每个片段首尾重叠15bp核苷酸，利用本试剂盒可将这些片段首尾连接形成全长片段，并克隆到载体中。

试剂盒组分：
Cloneget Enzyme     10 μl 
5X Cloneget Buffer     50 μl 
Manual     1 

本试剂盒-20°C条件下，保质期为一年 

使用方法：
A.    线性化质粒的制备
线性化质粒可通过PCR扩增，单酶切，或双酶切制备。质粒的线性化不彻底将导致阴性克隆的产生，所以一般建议通过双酶切或PCR扩增的方法进行质粒线性化。如使用PCR扩增获得线性化质粒，所用的Taq酶应选用高保真酶（如pfu酶）。 

B.    目标DNA的PCR扩增
利用PCR扩增目标DNA,所用的Taq酶应尽量选用高保真酶（如pfu酶）。利用本试剂盒克隆目标DNA，需要目标DNA的两端含有与载体两端相同的15bp核酸，所以设计引物时要将的这15bp的核酸加到特异性引物5’端，具体设计见下图： 
 

C.    目标DNA与载体的重组
1．    将下列混合物小心加到0.5ml的eppendorf管的管底，或PCR管的管底。（如果不慎将液体粘在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底）。

线性化载体                                 0.03 ～ 0.1 pmol
纯化的PCR产物                             0.06 ～ 0.2 pmol 
5X Cloneget Buffer                         2 μl
Cloneget Enzyme                           0.5 μl
去离子水                                  补足10μl

一般来说，反应体系中多添加一些PCR产物，会使阳性克隆增多，较长的PCR片段要增加其添加量，以维持其适当摩尔数目。对于不同大小的PCR片段，建议加入下列体积：

2.将其混合物在25°C保持30分钟，之后在冰上保持5分钟。
3.可立即进行转化，也可-20°C保存，以后再转化。

D.    转化
转化前请自行准备42°C 水浴，SOC液体培养基，DH5α 感受态细胞(>1×108 cfu/μg)
1.冰上融化一管50 μl的感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入5μl到8μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育30分钟。
2.42°C水浴中热激4590秒，冰上孵育2分钟。加800μl不含抗生素的SOC，37°C孵育45min。
3.6000 rpm离心2分钟收集菌体，用100μlSOC液体培养基重悬菌体。
4.将菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。